凈水處理劑-微生物絮凝劑（二）

2.3操作過程

以野生菌谷氨酸棒桿菌為出發菌株，該菌能夠以葡萄糖或鹿糖為碳源合成一種以半乳糖醛酸為主要結構單元的新型生物絮凝劑。進行紫外和甲基磺酸乙酯逐級誘變，獲得一株絮凝劑高產菌，獲得突變株，合成生物絮凝劑的最佳發酵條件：葡萄糖為碳源，尿素和酵母膏為氟源，培養基初始pH為4~8,種子最佳種齡16h,接種量5%,發酵催通風量1U,攪拌轉速100rpm。在此發酵條件下，絮凝活性最高可達到892U/mL。

為提高該菌株合成產量，采用傳統的物理化學誘變方法來對原有的絮凝劑產生菌株進行改造，以期從根本上提高菌株合成絮凝劑的能力，獲得絮凝劑高產變異株。

高效微生物的應用是有機難降解廢水實現高效處理的關鍵所在。國內外研究者已經篩選得到一些難降解有機物的高效降解菌。目前國內外研究較多的還有白腐真菌。與細菌相比，白腐真菌具有降解底物非專一性，對多種結構各異的有機污染物具有獨特的降解能力以及無需特定污染物的預條件化等優勢。白腐真菌產生的細胞外酶-木質素過氧化酶和猛過氧化物酶被認為是降解木質素和染料的恃殊酶系，其中研究最多的是黃孢原毛平革菌。

微生物絮凝劑絮凝活性高，而且作用條件粗放，因此可以廣泛應用于污水和工業廢水處理中。尋找高效微生物絮凝劑產生菌、提高絮凝活性、降低絮凝劑用量、低生物絮凝劑的生產成本是微生物絮凝劑能否在工業上推廣的關鍵所在。目前能降解石油的微生物多達200多種，由于微生物的數量和品種的廣泛使得人們能夠找到降解某種有機物的專一菌種，這無疑給難降解有機物的去除帶來巨大潛力和希望。

目前微生物絮凝劑的主要處理對象有活性運泥、粉煤灰、泥漿水、高嶺土、糞尿水、印染廢水、淀粉廢水等。

從發展勢態來看，微生物絮凝劑的高效特性將會成為水處理劑中的發展熱門。天然的生物絮凝劑（MBF)是一類由微生物產生的可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細胞及膠體等凝集、沉淀的特殊高分子代謝產物。該類絮凝劑是利用生物技術，通過微生物發酵、分離提取而得到的一種新型、高效、廉價的水處理劑。

產生MBF的微生物主要有霉菌、細菌、放線菌和酵母，主要用于混凝和脫色。MBF的制備目前集中在篩選菌種和培養基配方的研究，并取得很多進展，但同時存在成本高、菌種遺傳穩定性不夠、絮凝效果單一的問題，致使其難以投入實際應用。

例1

①蛋白胨乳酸鈉培養基（g/L):蛋白胨20g、酵母膏（牛肉膏10g、乳酸鈉4g、KH2PO40.5g、NH4C11g、N2S041g、七水硫酸鎂2g、L斗胱氨酸0.6g,蒸餾水稀釋至1000mL混勻，用20%NaOH溶液調節pH為7.2。用滅菌鍋在12°C保溫25min后，冷卻備用。

②改良培養基（g/L):酵母膏10g、葡萄糖20g、NaC5g、NH4C11g、KH2PO42g,蒸餾水稀釋至1000mL混勻，用20%NaOH溶液調節pH為7.2。用滅菌鍋在121°C保溫25min后，冷卻備用。

③巰基乙酸鹽培養基（g/L):胰化胨17.5g、大豆蛋白胨2.5g、葡萄糖10g、NaC5g、KH2PO42g、疏基乙酸鈉1g、瓊脂0.8g,蒸餾水稀釋至1000mL混勻，用20%NaOH溶液調節pH值為7.2。用滅菌鍋在121°C保溫25min后，冷卻備用。

首先，培養基的篩選。將三個菌種中的每一個菌種都接種到三種不同培養基中，在每種培養基中以硫酸擇形式分別加入鋅離子，濃度為50mg/L。

例2

以牛肉膏蛋白胨為細菌分離培養基，篩選用培養基（g/L):NaN0323g,KC0.9g,K2HP041g,MgS040.5g,FeS040.01g,蔗糖30g和蒸溜水1L,pH自然，121°C滅菌20min。

將分離到的單個菌株接種于篩選培養基中，各菌株于30°C、搖床轉速160rpm條件下培養60~72h,以2mL培養液對100mL0.4g/mL高嶺土懸浮液是否絮凝進行初篩。定量測定發酵液的絮凝活性，進行復篩。

例3

采用CorynebacteriumgtutamicumCC~CCM201005菌種，培養基如下：

斜面培養基（g/L):葡萄糖5,酵母膏1,牛肉膏1g,胰蛋白胨2g,硫酸亞鐵微量，瓊脂15?20g。

種子培養基（g/L):葡萄糖10g,酵母膏0.5g,磷酸二氫鉀0.1g,尿素0.5g,氯化鈉0.1g,七水硫酸鎂0.2g。

發酵培養基（g/L):碳源10g,氮源1g,礎酸二氫鉀0.1g,氯化鈉0.1g,硫麟0.1g。

篩選培養基（g/L):鄰苯二甲酸二丁酯10(mL),酵母膏0.5g,磷酸二氫鉀0.1g,尿素0.5g,氯化鈉0.1g,七水硫酸鎂0.1g。

以上培養基pH值均為8.0。

培養方法如下：

①種子培養：于新鮮斜面取一環菌，接入種子培養基（100mL/250mL三角瓶），28°C,120rpm振蕩培養16h。

②搖瓶培養：將培養16h的種子液以5%的接種量接入發酵培養基（100mL/250mL三角瓶），28°C,120rpm振蕩培養48h。

③小罐分批培養：以5%(V/V)的接種量將種子培養液接入裝有2L發酵液的3L發酵罐中，通氣量為1U,攪拌轉速100rpm,28°C,溶氧在線自動檢測。

④紫外誘變方法：于新鮮斜面取一環菌接入種子培養基），28°C、120rpm培養16h,離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗涂菌體三次，制成菌體濃度約為107個/mL的單細胞菌懸液，將此單細胞菌懸液于紫外燈下照射60s后，按5%的接種量接至發酵培養基中，28°C、120rpm暗室培養過夜，按稀釋法涂布于篩選平板上，28°C恒溫培養至菌落生長良好，菌落進行篩選。

為了獲得更高的突變率，進一步提高絮凝劑產量，在紫外誘變的基礎上，對菌株繼續利用化學誘變劑進行策二次誘變。經過二次誘變后，盡管某些菌株的絮凝劑合成能力不是非常穩定，但總體而言，菌株合成絮凝劑的能力均得到顯著提高。

例4

所用培養基：牛肉膏蛋白胨固體：牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaC5g。瓊脂15~20g,H2O1L,pH為7.2~8.0。

查氏培養基：蔗糖30g,NaN033g,K2HPO41g,FeS040.01g,KC0.5g,MgS04.7H2O0.5g,H0O1L。

通用發酵培養基：葡萄糖20g,(NH4)2S040.2g,脲0.5g,KH2PO42g,K2HPO45g,NaCO.1g,酵母膏0.5g,H2O1L;

一號培養基：可溶性淀粉20g,KN033g,K2HP040.5g,Mg-S04.7H20O.5g,FeSCU0.01g,NaC0.5g,H2O1L。

篩選方法：將菌種稀釋接種于固體瓊脂平板單菌種接種于相應的平板，待充分生長后接種于發酵培養液中進行淺層發酵，控制條件為：水浴溫度30°C,揺床轉速為120rpm,pH為7左右，發酵時間72h。取發酵液測其絮凝活性，將具有良好的絮凝活性的菌株作為復篩菌種。

首先觀察菌株在培養基中的生長狀態，再通過巨大菌落觀察和載片培養，進一步確定菌株的屬種。

例5

高糖低氮培養基有利于絮凝劑的產生。適宜搖床發酵條件為：初始pH為7.5~8.5,培養溫度30°C,搖床轉速180rpm,發酵60h;在揺床優化的培養條件的基礎上進行5L罐放大試驗，發酵周期縮短12h,絮凝活性提高14.45%。

斜面培養基（％):

蛋白胨1.0;牛肉膏0.3;NaC0.5;瓊脂1.5;pH為7.00。

發酵培養基（％):

葡萄糖1.0;果糖1.0;酵母膏0.05;脲0.05;(NH4)2S040.04;蛋白胨0.05;MgS040.02;KH2P040.5;NaC0.02;pH為8.0。

培養條件：

①搖瓶培養：從斜面轉接種環菌，放于盛有30mL?酵培養基的250mL三角瓶中，回轉式揺床30°C、180rpm培養60h。

②發酵罐培養：3.0ml發酵培養基裝于5L發酵罐中，溶氧水平控制在30%,pH控制在8.0左右，30°C培養。

例6

菌株從旱田土壤中分離。

斜面培養基：牛肉膏10g/L,蛋白腺5g/L,NaC5g/L,瓊脂15g/L,pH為7.2。

發酵培養基：蔗糖10g/L,牛肉膏6.6g/L,MgS04.7H2O0.2g/L,FeCI30.01g/L,pH為7.0。

121mL到80mL發酵培養基中，在30°C,150rpm條件下培養，間歇測定1ml培養基上清液對一定濃度高嶺土懸浮液的絮凝活性。

該菌株所產絮凝劑的絮凝特性。在堿性條件下該絮凝劑對高嶺土懸浮液具有良好的絮凝效果，且具有產生快、熱穩定性強等特點，具有潛在的應用前景。

例7

產生絮凝劑的培養基：酵母法20g,KH2P041g,MgS04.7H20.5g,水1L,稱之為YA培養基。在上述培養基的基礎上改變初始pH值，碳氮源及其比例。

細菌鑒定所用培養基：伯克培養基（無氮培養用），硫化氫試驗用培養基。

將菌源分別接種于牛肉膏蛋白陳培養基上，分別純化多次。對分離純化所得各菌株進行液體YA培養基與牛肉膏蛋白陳培養基發酵培養，培養振蕩72h;分別測定培養液的絮凝活性。

例8

絮凝劑產生菌枯草桿菌：污泥和土壤樣品經稀釋后涂布于分離培養基中，37°C培養2天后檢出高黏度、生長快的菌落。將分離得到的菌種接種到發酵培養基中，于旋轉式搖床上（轉速220rpm),37°C培養24h后檢測發酵液的絮凝活性。挑取高效菌株用于下一步試驗。

分離培養基：葡萄糖1%,酵母膏0.5%,谷氨酸鈉0.5%,KH2PO4、0.05%；MgS04、0.01%,瓊脂2%,pH值7.0。

基礎培養基：酵母膏0.5%,KH2PO4、0.O5%；MgS04、0.01%,pH值7.0。

種子培養基：葡萄糖2%,酵母膏0.5%,K2HP04.3H2O0.2%,MgS040.025%,谷氧酸鈉1%,pH值7.0。

發酵培養基：葡萄糖3%,酵母膏0.8%,K2HPCV3H2〇g.2%，MgS040.025%,谷氧酸鈉1%,pH值為7.5。

培養條件：取1環菌體接種于種子培養基（500mL三角瓶裝液量50mL),在轉速220rpm,32°C條件下振蕩培養15h,然后按1%接種量接種于發酵培養基培養。

產物的提取：離心去除發酵液所含細胞，上清液用3倍體積的乙醇進行沉淀，得黏性沉淀物，干燥得粗品，將粗品溶于蒸餾水后過夜透析，透析液經冷卻等后處理得成品。

例9

將核桃殼，粉碎成粒徑為0.5~2.0mm范圍內的顆粒，經高溫蒸煮并加入堿性藥劑，進行脫脂處理，脫脂后的核桃殼碎粒進行清洗及搓洗脫皮處理，填充反應柱，填充密度為500g/L。

利用SDA(沙保羅瓊脂培養基）從空氣中分離到一株脫色真菌，為黑曲霉，在溫度28~33°C,pH值為4~8脫色率最高。將在30°C用5DA平板純培養5天后的菌種，用15mL無菌水洗下制成孢子懸液，按5%的接種量，將孢子懸液接種于裝有40mL改進的馬丁培養基的250mL搖瓶中，30°C下，150rpm振蕩培養，培養數小時后，作為第一反面柱中固定化菌液。

反應器為兩個串聯的玻璃柱，將核桃殼顆粒填入反應柱，把已準備好的菌液分別對應接入裝有模擬水樣的1#柱和2#柱中靜態培養掛膜。待水樣色度上除后，進行通氣培養，并添加少量生長培養基。每天換掉1/3上清液，待1#柱中核桃殼顆粒上生長出淡黃色生物膜。2#柱中核桃殼顆粒上生長出淺灰色生物膜后，以0.05L/h的小流量通水樣，經動態培養，生物膜逐漸成熟，即可處理印染廢水。用于處理廢水，去水率94%,脫色率為99.4%。

例10

采用產氣腸桿菌：培養基質量濃度（g/L):葡萄糖10.0,果糖10.0,酵母膏0.5,脲0.5,(NH4)2SO4、0.4,蛋白胨0.5,MgSO4、0.2,KH2PO4、5.0,NaC、0.2；0.1MPa下滅菌20min。

培養條件：將斜面菌種轉接于盛有30mUg養基的250mL三角瓶中，在30°C,180rpm條件下揺床培養60h得培養液。

培養液離心去菌體，上清液4°C預冷后用1倍體積的丙酮沉淀，離心，沉淀用質量分數70%乙醇洗滌二次，真空干燥得到部分純化的絮凝劑干粉。

將菌種稀釋接種于固體瓊脂平板，挑取單菌種接種于相應的平板，待充分生長后，接種于發酵培養液中進行淺層發酵實驗，實驗條件：水浴溫度30°C,揺床轉速為120rpm,pH值7左右，發酵時間72h。取發酵液測其絮凝活性，將具有良好的絮凝活性的菌種株作為復篩菌種。

經多次富集和劃線分離，從活性污泥中篩選出霉菌，對高嶺土懸液的絮凝力達97%。